تشعع بلورات البروتين لإنتاج نماذج الانعراج

تعرض البلورة الموضوعة في أنبوب شعري لحزمة من الأشعة السينية أحادية اللون وتدار بحيث تنتج الحزمة الساقطة كافة نماذج الانعراج المحتملة. ويحتاج الأمر لعدة بلورات لأن لكل منها عمراً محدوداً في حزمة الأشعة السينية، فالأشعة السينية ننخرب البروتين وجزيئئات المذيب مما يؤدي إلى إنتتاج جذور حرة تحدث المزيد من التخريب البروتيني. وبما أن الحرارة تتولد أيضاً، يعكن أن تبرد البلورات لزيادة عمرها المفيد. وتؤمن الأشعة السينية إما من مصعد دوار مولد للأشعة السينية، أو من حلقة تخزين سينكروترونية (Synchrotron storage ring). ويعطي مولد الأشعة السينية بالمصعد الدوار، وهو صفيحة معدنية دوارة تقذف بالإلكترونات، أشعة سينية أحادية اللون (ذات طول موجي واحد).

وتنتج الأشعة السينية متعددة الألوان — والأكثر قوة بكثير من الأولى — في حلقات تخزين السينكروترون بتحريك الإلكترونات بسرعات قريبة من حركة الضوء عبر موحد اللون (Monochromator) أولا لاختيار الأشعة السينية أحادية اللون. ثم تتبعثر الأشعة السينية بنماذج تعتمد على كثافات الإلكترونات في مختلف أجزاء البروتين. وتسجل نماذج الانعراج الناتجة على فيلم فوتوغرافي أو بعداد أشعة يدعى مكشاف المناطق (Area detector) (الشكل 6-11). وبعد ذلك تقاس كثافاث الانعراج الأعظمي وتحلل حسابياً وتستخدم لوضع خرائط لكثافة الإلكترونات.

شكل 6-11 : مثال عن صورة فوتوغرافية محاصة بالأشعة السينية. ما يشاهد هو نموذج انعراج مأخوذ على طول المحور ثلاثي التضاعف (III) للبلورات المكعبة المختزلة HMG-CoA من الزائفة الميفالونية.

تسمح معرفة المدى والأطواد بوضع خريطة لكثافة الإلكترونات:

هناك ثلاثة معالم تميز كل حزمة متعرجة وهي المدى (Amplitude) والطول الموجي (Wavelength) والطور (Phase)، والأخير هو الوحيد الذي يكون مجهولا. ويقوم حل مشكلة الطور عموماً على استبدال متشاكل متعدد Multiple) (isomorphous replacement بحيث يدخل معدن ثقيل أو بين أخر مميز سلفا إما بالتبلور المتزامن (Co-crystallization) أو بالانتشار في البلورة الموجودة نحلل بعد ذلك التغيرات في نموذج الانعراج لتحديد الأطوار بعمليات رياضية تشمل وضع خرائط باترسون (Patterson maps). وتستخدم الأطوار والمدى لحساب خريطة كثافة الإلكترونات للوحدة المتكررة من البلورة.

وتمثل خرائط كثافة الإلكترونات سلسلة من المقاطع المتوازية عبر البروتين ممثل فيها خطوط الكفاف (Contour lines) القريبة من بعضها بعضاً مناطق التغير الكبير في كثافة الإلكترونات. وتماثل خرائط كثافة الإلكترونات الخرائط الطبغرافية التي ممثل فيها خطوط الكفاف القريبة بعضها من بعض مناطق يتغير فيها الارتفاع بشكل حاد. ولقد استخدمت مخزونات. خرائط كثافة الإلكترونات المرسومة على مادة شفافة لتقليد خريطة كثافة الإلكترونات ثلاثية الأبعاد التي أنشئ منها اجتهاداً النموذج الفيزيائي للسلسلة الرئيسية من البروتين بشكل اجتهادي. ولكن التحليل البنيوي المعاصر يستخدم الحواسيب التي تعرض خرائط كثافة الإلكترونات بكفاف ثلاثي الأبعاد بحيث يعكن مطابقتها بالعين مع البنية الأولية المعروفة للبروتين (الشكل 6-12)