مرض التدرن التاجي Crown Gall

الممرض (Pathogen):

يتسبب مرض التدرن التاجي عن الإصابة ببكتريا Agrobacterium tumefaciens. عزلت هذه البكتريا اول مرة من العنب بإيطاليا سنة 1897 من قبل Fridiano Cavara وفي سنة 1907 عزلت من أورام نبات الزينة الأقحوان في الولايات المتحدة. حظيت هذه البكتريا والمرض الذي تسببه باهتمام كبير في محاولة لمعرفة آلية إحداث المرض وتطوره لعله يلقي مزيدا من الضوء على الأمراض السرطانية ككل مع التسليم بوجود فروقات مهمة بين السرطانات النباتية والحيوانية بسبب الفروقات النسيجية والخلوية والمسببات وبعد اكتشاف وجود المحفزة للورم (Tumor Inducing Principle) على بلازمية البكتريا الذي سمي plasmid والذي له القدرة على الاندماج بجينوم العائل ولكون البكتريا واسعة المدى العوائلي فقد فتحت المجاز، أمام استخدامها كوسيلة لنقل الجينات المرغوبة إلى النباتات ضمن طرق الهندسة الوراثية ( 1988, Han et al. 2000: Binns & homashow Goodner et al., 2001 ).

تصيب البكتريا Agrobacterium tumefaciens أكثر من 600 نوعا من نباتات ذوات الفلقتين تعود إلى أكثر من 140 جنسا تتوزع على أكثر من 93 عائلة نباتية. تستخدم نباتات الداتورا Datura stramonium وعباد الشمس Helianthus annuus التقدير ضراوة البكتريا لحساسيتهما العالية للإصابة.

من النباتات الحساسة للإصابة أشجار التفاح والكمثرى والكرز والمشمش واللوز والجوز ونباتات الزينة الخشبية كالورد وزهرة الاولوية (Margtterite daisies) والأقحوان وكذلك الأعناب والتوت البري التي يمكن أن تصاب جهازيا والمحاصيل الحقلية كالقطن والبنجر السكري والطماطة والفاصوليا والجت مع انها لا تؤثر على مثل هذه المحاصيل اقتصاديا.

الأعراض (Symptoms)

أعراض المرض تكون بشكل نموات زائدة تظهر على الجذور وقاعدة الساق أو التاج. الأورام تكون في البداية فاتحة اللون ملساء قوية صلبة لكنها ألين من أنسجة الساق، مع الوقت وبعد سنة من تكونها تصبح مجعدة وتحتوي على تجاويف وتصير سهلة التفتت ويمكن أن تأوي انواع من الحشرات. حجم الأورام يتراوح بين حجم حبة البازليا إلى بضع سنتمترات وقد يتعدى قطرها 30 سم. يتألف الورم من أنسجة العائل المشوهة أحيانا يمكن أن تنشا أورام ثانوية فوق الأورام الأولية على الساق في بعض النباتات العائلة.

شكل يبين: أورام متسببة عن الإصابة بالبكتريا A. tumefaciens على نبات عباد الشمس (يسار) وورم ضخم على جذع شجرة Fraxinus excelsior في استراليا (يمين)

عن: (2001,Winstead)

هذه الأورام الثانوية تتكون بشكل كتل نسيجية منفصلة مستمرة تخرج إلى السطح بعد تمزق القلف. الشيء الذي يميز هذه الأورام البكتيرية عن تلك التي تتكون بسبب الحشرات هو كونها صلدة. إن إصابة الشتلات أو الأقلام بالمرض أي الإصابات المبكرة تؤدي إلى ظهور أعراض التقزم وانخفاض الإنتاج. كما أن إصابة الجذور المزمنة تؤدي إلى ضعف نمو النبات واختزال في عدد الأوراق وأعراض الإجهاد المائي. من العلامات المميزة المرافقة لإصابات الأشجار تكون الجذور الثانوية قرب قاعدة النبات والتي تشير إلى إصابة الجذور.

عند تحسس البكتريا لمركبات فينولية (Dimethoxyl Phenolic Compounds) وسكريات أحادية وبعض حوامضها (Arabinose و Galactose و Galacturonic acid  و Glucuronic acid و Mannose و Fucose و Cellobiose و Xylose و Glucose) بالترافق مع الحموضة (pH 5.2-5.7) ودرجات الحرارة دون 30 م تنطلق من جذور النبات المجروحة (مع وجود دلائل عن عدم الحاجة إلى الجروح Winans & Brencic 2005,)) يتم التعبير عن جينات الضراوه المحمولة على البلازميد Ti ويتكون هدب خيطي طويل مرن يسمى هدب T كما يترافق ذلك مع توقف الحركة حيث تتصل البكتريا بخلايا النبات وهي المرحلة الأولى في الإصابة.

شكل يبين: صورة البكتريا A. tumefaciens تحت المجهر (يمين) ورسم تخطيطي لخلية البكتريا (يسار)

عن: (2001,Collins) و (2002 ,Kado)

شكل يبين: خلايا البكتريا A. tumefaciens تلتصق بخلية نبات

عن (2001,Winstead)

البلازميد Ti يحتوي على جزيئة T-DNA) DNA) كبيرة خارج الكروموسوم تتألف من حوالي 200 ك . ق (كيلو قاعدة) تشكل دائرة من شريط مزدوج مغلقة تساهميا. البروتينات المسؤولة عن معالجة ونقل T-DNA تشفر في منطقة vir للبلازميد Ti. ثمة 21 جين في هذه المنطقة ضرورية من أجل تحقيق مستويات الإمراضية للطراز البري ويتم التعبير عنها في 6 أوبرونات هي virA و virB وvirC  و virD و virE و virG Brencic & Winans, 2005)).

عند التعرف على الجزيئات الإشارية الفينولية الصادرة من النبات يشفر جين الضراوه virA للإنزيم (Histidine Kinase (VirA الذي يفسفر منظم الاستجابة (VirG) الذي بدوره ينشط عن طريق النسخ بقية جينات الضراوة (vir genes). تقوم نواتج جينات الضراوة بمعالجة T-DNA ونقلها إلى خلية النبات ما أن تستلم الجزيئات الفينولية الإشارية من قبل VirA فإنه يوقف حركة البكتريا.

تسهم بعض الجينات الكروموسومية للبكتريا مثل chv و att في ضراوة البكتريا بالمساعدة في تحقيق الاتصال بالخلية العائلة وترويج التعرف على الجزيئات الإشارية وتنظيم بعض جينات الضراوة وجينات T-DNA.

شكل يبين: تنظيم جينات الضراوة في البكتريا A. tumefaciens بواسطة الجزيئات الإشارية المتحررة من النبات (A) شلال جينات vir المنظم يتضمن نظام VirAvirG الثنائي المكون والبروتين الرابط للسكر VirA . ChvE هو Histidine kinase غشائي يتحسس الفينولات والسكريات والحموضة المتحررة من النبات وتفسفر VirG منظم الاستجابة الرابط لذ DNA. يتم تحسس الـ pH الحامضي والفينولات بواسطة القطاع الرابط لـ VirA بينما يتم تحسس السكريات بواسطة البروتين المشفر من الكروموسوم ChvE. ويقوم ChvE، وهو بروتين فوق بلازمي رابط للسكريات يتصل مع القطاع فوق البلازمي لـ VirA، بتشجيع فعالية VirA المحفزة بالفينولات VirG المفسفر ينشط نسخ جينات vir وأوبرون repABC المطلوبة في تضاعف بلازميد B) .pTi) نموذج تنظيم نشاط كاينيز للثنائي المكون .Vira كل وحدة من VirA تتألف من قطاعات فوق بلازمي ورابط وكاينيز ومستلم إشارة وكل قطاع كاينيز إلى تحت قطاع مانح ومستقبل للفوسفات حيث يحتوي على موقع رابط لـ ATP وتحت قطاع مستقيل للفوسفات، الإشارات البيئية ترسل من قطاعات فوق البلازم والرابط لوحدة المعقد المحتوي على تحت القطاع المانح للفوسفات إلى معقد يحتوي على تحت قطاع مانح للفوسفات من نفس الوحدة وقطاع مستلم للفوسفات من تحت وحدة مقابلة بطريقة مشابهة القطاع المستلم لكل وحدة تثبط المعقد المؤلف من تحت قطاع مانح للفوسفات لنفس تحت الوحدة والقطاع المستلم للفوسفات من الوحدة المقابلة أيضا القطاع المستقبل لكل تحت وحدة يثبط المعقد المؤلف من تحت قطاع مانح للفوسفات لنفس تحت الوحدة وقطاع مستقبل للفوسفات من تحت الوحدة لمقابلة

عن: (2005,Brencic & Winans)

إن انتقال T-DNA من البكتريا إلى خلية النبات العائل يتم من خلال هدب طويل مرن هو هدب T حيث يصدر بشكل جزيئة مفردة الشريط مرتبطة ببروتين VirD2. وعند دخولها نواة الخلية العائلة تندمج جزيئة T-DNA بأحد الكروموسومات. حينها يتم التعبير عن جينات T-DNA البكتيرية بواسطة آليات النسخ التابعة لخلية النبات. إن نواتج جينات T-DNA تحفز تكوين هرمونات الأوكسين (Auxin) والسايتوكاينين (Cytokinin) والأوبينات (Opines)، زيادة إنتاج الأوكسين والسايتوكاينين يؤدي إلى الانقسام والتوسع والنمو غير المنضبط لخلايا النسيج المصاب. توفر الخلايا النباتية المحولة وراثيا (المصابة) مشتقات أحماض أمينية وسكريات هي الأوبينات كمصادر غذائية فريدة حيث تستغل كمصادر نتروجين وكاربون في تغذية البكتريا A. tumefaciens. في الوقت الحاضر يعرف أكثر من 20 أوبين تقسم إلى عوائل مثل عائلة Octopine (يحضر بالتكثيف الاختزالي لحامض البايروفيك مع الأحماض الأمينية Arginine و Omithine و Lysine أو Histidine) وعائلة α-ketoglutarat) Nopaline مع Arginine أو Ormithine) وعائلة Mannityl وعائلة Mannopine وعائلة Amadori وعائلة .Agrocinopines سلالات البكتريا A. tumefaciens المختلفة تحفز العائل على إنتاج أوبينات مختلفة وكل سلالة تستقطب إلى الأوبين المناسب لها. أخذ الأوبين من قبل البكتريا يتم بواسطة بروتينات Permeases عالية الميل لها تابعة إلى نوع .ABC في الوقت نفسه تساعد بعض الأوبينات في نقل بلازميدات Ti بين خلايا سلالات البكتريا، فبعض الأوبينات مثل Octopine و Agrocinopine  تعمل كمحفزات في نظام نقل بلازميدات Ti.

تلقيح نبات الداتورا الحساس بالبكتريا A mefaciens. الضارية يؤدي الي تكوين الورم خلال اسبوعين البكتريا A. tumefaciens عصوية 13 X  مكم، سالبة لصبغة كرام، تحمل اسواط محيطية تحت قطبية وهي هوائية مجبرة وتتواجد طبيعيا على سطح الجذور أو مرافقة لجذور العديد من النباتات بما فيها نباتات الأدغال. كما تتمكن البكتريا من المعيشة الحرة في الترب المزيجية التي نمت فيها نباتات اصيبت بالمرض لا يمكن عزل البكتريا من الأورام القديمة كونها تتألف من أنسجة ميتة بينما يمكن عزل البكتريا من الأورام الحديثة.

على اساس بعض الفروقات في الطرز المظهرية ميزت البكتريا A. tnamefaciens  إلى 3 طرز ببلوجية (Biotypes) أو ضروب بيولوجية (Biovars) الطرز البيولوجية l و l و lll أو الضروب البيولوجية 1 و 2 و 3. الطراز البيولوجي l أو الضرب البيولوجي l تكون سكريات كيتونية (ketosugars3) ويكون لها مدى عوائلي واسع.

والطراز البيولوجي II أو الضرب 2 يصنف على انه البكتريا المسببة لتكون الجذور الشعرية A. rhizogenes.

الطراز البيولوجي lll أو الضرب 3 ينحصر في إصابة نباتات العنب وعزلاته تفضل استغلال حامض الترتريك (L-tartaric acid) على الكلوكوز وتكون إنزيم Polygalacturonase.

ونظرا للتماثل الوراثي ومحدودية المدى العوائلي على العنب أعيد تصنيف هذه المجموعة لتشكل النوع Agrobacterium vitis. والعزلات التي تصيب أفلام نباتات جنس Rubus مثل التوت الأسود (Blackberry) والتوت البري (Raspberry) تتمثل بالنوع Kado,2002) Agrobacterium rubi).

لبكتريا A. tumefaciens سلالة C58 جينوم غير اعتيادي فهو يضم 4 مكونات وراثية هي كروموسوم دائري 3000 ك ق وآخر خطي 1200 ك ف واثنان من البلازميدات احدهما 450 ك ق والآخر وهو بلازميدTi  200 ك ق (1993 ,.Allardet-Servent et al. العديد من البكتريا تمتلك كرومسوم دائري وبعضها يمتلك كروموسوم خطي لكن البكتريا A. tumefaciens هي النوع الوحيد المعروف بامتلاكه للنوعين معا (2001 Winstead).

جينوم هذه البكتريا يتكون من 5400 جين مؤلف من 5.67 مليون قاعدة نتروجينية. ثمة تقارب شديد بين جينوم البكتريا A. tumefacients. وجينوم البكتريا المثبتة للنتروجين المتعايشة مع النباتات البقولية Sinorhizobium meliloti ويبدو أن الفرق البسيط في جينات الضراوة لبكتريا التعقد التاجي عن جينات البكتريا النافعة هو الذي يقرر ما إذا كانت البكتريا نافعة أو ضارة (1,2001 Wood el).

إن سلالات البكتريا A. tumefaciens الفاقدة لبلازميد Ti أو التي تفقده من خلال المعاملة بالحرارة تفقد القدرة على إحداث المرض (1997 .Agrios).

شكل يبين: مخطط جينوم البكتريا A. tumefaciens يبين الكروموسوم الدائري والكروموسوم الخطي وبلازميد Ti (مكبر 10 مرات عن الكرموسوم) وبلازمید آخر (مكبر 5 مرات عن الكرووسوم).

عن: (2001,Winstead)

تطور المرض (Development of Disease)

تستوطن البكتريا A. tumefaciens سطوح جذور النباتات الاقتصادية والأدغال وفي التربة بعد تفتت الأورام المنفصلة من الجذور المصابة نتيجة العمليات الزراعية. يمكن أن تبقى البكتريا في التربة لمدة سنتين أو أكثر حتى بغياب النباتات الحساسة ويمكن أن تحمل على سطوح البذور احيانا.

تنتشر البكتريا من خلال زراعة الشتلات أو الأقلام المصابة ويساعد ماء الري على مزيد من انتشار البكتريا في التربة. تساعد عمليات القص والتقليم بالأدوات الملوثة بالبكتريا على نشر لقاح البكتريا، كما ان النيماتودا والحشرات يمكن أن تحدث جروحا تنفذ من خلالها البكتريا.

شكل يبين: ملخص دورة حياة البكتريا A. tumefaciens

عن: (Kado, 2002)

إن زراعة شتلات أو اقلام جديدة حتى وإن كانت سليمة كترقيع في موقع الأشجار المصابة يؤدي إلى إصابتها بسبب تلوث التربة اصلا.

ومع ان الورم يمكن أن ينشأ نتيجة تحول خلية نباتية واحدة بسبب الإصابة بالبكتريا إلا أن زيادة حجم اللقاح البكتيري يؤدي إلى زيادة حجم الورم الأولي وسرعة تكونه (1996 ,Kado, 2002 : Nameth & Chatfield).

الجروح الناتجة عن العمليات الزراعية المختلفة أو الناتجة عن أذى البرد والظروف البيئية المتطرفة توفر مداخل لبكتريا Kado, 2002) A. tumefaciens).

السيطرة على المرض (Control)

1- زراعة الشتلات والأقلام السليمة، علما ان الفحص العياني يمكن أن يستبعد الشتلات أو الأفلام المظهرة للأورام لكنه يفشل في كشف الإصابات الجهازية في حالة العنب وغيره من النبتات القابلة للإصابة الجهازية.

2- المكافحة الحيوية: تستخدم البكتريا القريبة غير الممرضة للنبات A. radiobacter في المكافحة الحيوية لسلالات البكتريا A. tumefaciens الحساسة للمضاد الحيوي 84-Agrocin الذي تنتجه البكتريا المضادة. هذا المضاد الحيوي هو شبيه للأوبين Agrocinopine A الذي تنتجه البكتريا الممرضة وله دور في حصول الإصابة. المضاد الحيوي المأخوذ من قبل البكتريا الممرضة يؤدي إلى تثبيط تضاعف البكتريا الممرضة وبالتالي يساعد في مكافحة المرض. لكن هذه البكتريا المضادة لا تكون فعالة مع سلالات البكتريا الممرضة غير الحساسة للمضاد الحيوي. تتم عملية المكافحة الحيوية عن طريق غمر جذور الشتلات في عالق البكتريا المضادة.

3- الهندسة الوراثية: تقوم شركات التقنية الحيوية بإنتاج نباتات محورة جينيا تصبح مقاومة للإصابة ببكتريا A. tumefaciens يتم ذلك بإدخال جينات إلى النبات المحور تشفر لنواتج تحلل أو تثبيط معقد شريط T-DNA عند دخوله الخلية النباتية، هذا سوف يثبط عملية التعبير الجيني لشريط T-DNA المشفر لإنتاج الأوكسين والسايتوكاينين. وتستخدم شركات اخرى جزيئات RNA تكسب مقاومة للنبات ضد الإصابة بهذه البكتريا.

4- الدورة الزراعية مع محاصيل الحبوب يمكن أن يخفض لقاح البكتريا (2002 Kado).