طرق فصل الانزيميات

تقوم الطرائق التقليدية المستخدمة لتئقية البروتينات على الترسيب بالتراكيز الملحية المختلفة (غالبا سلقات الأمونيوم أو الصوديوم) أو استخدام المذيبات (الأسيتون أو الإيثانول)، أو التمسخ التفريقي بالحرارة أو بدرجات الباهاء (pH) المختلفة، أو التتبين التفريقي، أو الترشيح الهلامي، أو الرحلان الكهربي. وبعد امتزاز (Adsorption) البروتينات وشطفها (Elution) الانتقائيان باستخدام مبادل الايونات السلولوزي (ثنائي إي٦ دل أمينو إيثيل السلولوز (DEAE)) ومبادل الكاتيونات (كربوكسي ميثيل السلولوز (CMC)) من الطرائق الناجحة جدا أيضاً في تتقية البروتينات.

ونسوق هنا المثال التالي: تعدل باهاء (pH) الخلاصة المائية للنسيج الكبدي إلى القيمة 7.5 التي jحمل عندها معظم البروتينات شحنة سلبية صرفة. يطبق بعد ذلك المزيج من البروتينات الذوابة على عمود سلولوز DEAD مدروء عند الباهاء (pH 7.5 ) التي يكون عندها ال DEAD مشحونا بشحنة إيجابية. هذا يؤدي إلى ارتباط البروتينات المشحونة سلباً بالـ DEAD بتآثر الشحنات المتعاكسة، بينما تعبر البروتينات غير المشحونة أو المشحونة إيجابياً العمود مباشرة؛ ثم يشطف العمود باستخدام مدروج محلول كلور الصوديوم في دارئة باهاؤها 7.5 (بدءا بالتركيز المتخفض). وبما أن أيونة الكلور السلبية تنافس البروتينات على الارتباط بالدعامة المشحونة إيجابياً، تشطف البروتينات انتقائياً بحيث تنفك البروتينات ذات الرابطة الأضعف مع الدعامة أولا تليها المرتبطة بقوة أكبر وهكذا.. وممكن أيضاً استخدام دعامة مشحونة سلبياً مثل كربوكسي ميثيل السلولوز أو فسفو السلولوز عند باهاء منخفضة نسبياً لضمان شحن البروتينات بشحنة إيجابية أكبر.

سكن أيضاً فصل البروتينات على مواد مسامية (Porous) تعرف باسم «المناخل الجزيئية» (Molcular sieves). وعند تطبيق مزيج البروتينات على العمود الحاوي على منخل جزيئي، توزع البروتينات الصغيرة نفسها في الفراغات بين الجزيئات وفي المسامات الداخلية للدعامة معاً. وعندما يعبر مزيج من البروتينات مختلفة الأحجام خلال العمود، تعاق حركة البروتينات الصغيرة نسبة للبروتينات الكبيرة لدرجة لا تسمح لها بدخول المسامات. وهكذا تخرج البروتينات الكبيرة من العمود قبل البروتينات الأصغر حجماً. ويمثل بووفيل (شاكلة) الشطف (Elusion profile) البروتينات متدرجة من الأكبر ربماً إلى الأصغر. ولا بد من أن نذكر هنا أن المناخل الجزيئية تتصف بقدرة محدودة وأنها لا تستخدم عموماً إلا بعد إنحاز تنقية سابقة بالطرق الأخرى.