طرق التحسين الوراثي للموالح (التهجين في الموالح)

اعتمدت معظم برامج التربية في الموالح على الطرق التقليدية لإنتاج أصناف أو أصول عن طريق إجراء تهجينات محددة وانتخاب السلالات الممتازة من آلاف البادرات في الحقل (1986,Hearn). وتشمل تربية الأصناف المتميزة (أصناف ذات جودة عالية) بانتخاب أنواع من آباء ذات صفات موروثة متميزة، وعادة تختار الأم بحيث تكون منتجة لأجنة جنسية فقط وتختار الآباء أساسا من أجل قدرة ائتلاف مرتفعة حتى يكون هناك احتمال أكبر لنقل الصفات المرغوبة إلى الأنسال. فمثلا أصناف Murcott وبرتقال Page تحتوي على العديد من الصفات الموروثة المرغوبة ولكن نظرا لأن قدرتها الائتلافية ضعيفة فإن فائدتها في برامج التربية تكون محدودة، وبصفة عامة يكون مجتمع البادرات متباينا بدرجة كبيرة في صفاته الخضرية والثمرية نظرا لأن الموالح غير متجانسة وراثيا بدرجة كبيرة، وتهتم برامج التربية بتربية الأصناف وتربية الأصول.

وتتم تربية الأصناف من خلال عدة خطوات يمكن إيجازها فيما يلي:

• يجري التهجين المرغوب وبعد نضج الثمار وخاصة البذور تجمع بذور الهجين وتحفظ إلى أن تزرع في الصوب ثم في الحقل ويحتفظ بالبادرات حتى الإثمار والذي قد يستغرق ما يقرب من عشر سنوات أو أكثر لمرورها بطور الشباب والذي يكون بصفة عامة طويل في الموالح، وأثناء هذا الطور (طور الشباب) فإنه يمكن تقييم البادرات بالنسبة لمقدرتها على مقاومة الحشرات والأمراض والصقيع وصفات النمو العامة.

• تطعم البادرات ذات المواصفات المرغوبة على أصول مختلفة ومن ثم يتم زراعتها في المزرعة للتقييم بعد الإثمار وهذه الأشجار تثمر خلال أربعة أو خمسة سنوات تقريبا.

• تقييم الإثمار ونوعيته ومختلف مواصفاته.

• إعطاء الأشجار المنتخبة إلى بعض المشاتل للإكثار ولإجراء اختبارات إضافية في الحقل.

ومن الواضح أن هذه الطريقة تحتاج إلى وقت طويل، فعلى سبيل المثال أعتمد التانجرين Robinson كصنف عام 1959 بينما كان التطعيم المبدئي له في 1942.

وفي حالة تربية الأصول فتتبع نفس الطرق العامة في تربية الأصناف مع بعض الاستثناءات (1985 ,Hutchison, 1985 Barrett) وتتم كما يلي:

• يزرع مجتمع كبير من التهجين المبدئي ويلاحظ حتى الإثمار بعد 5-6 سنوات، وفي حالة الأصول يجب أن تنتج الثمرة عدد كافي من البذور كما يجب أن تكون البذور بها أجنة نيوسيلية حتى يمكن إنتاج أصول بكمية كبيرة ومتجانسة.

• تزرع الأصول ذات المواصفات المتميزة في المزرعة بعد إنمائها في الصوب، ثم تقييم لمقاومة الأمراض في التربة، وفي العديد من الحالات يمكن إجراء الاختبار السابق في مرحلة مبكرة لتحديد مقاومة الأصول للتصمغ والنيماتودا.

• الأصول التي تثبت جودتها في هذا المجال يتم تطعيمها بطعوم وتزرع في المزرعة لمدة من 5-10سنوات لتحديد درجة توافقها مع الطعوم، بالإضافة إلى تقييم تأثير الأصل على النمو الخضري والمحصول والمواصفات الثمرية للطعوم وكذا المقاومة للصقيع والحشرات والأمراض.

وتحتاج هذه العملية حوالي عشرون عام لذلك ليس من المستغرب أن يبحث مربوا الموالح عن طرق بديلة لاختصار هذه المدة. وفيما يلي نتناول الإجراءات وطرق إجراء التهجينات في الموالح وكيفية تقييم البادرات الناتجة مع الإشارة إلى أهم الاعتبارات التي يجب أن يتنبه لها القائمين على تنفيذ برنامج تربية وتحسين الموالح بالتهجين والتي نوجزها فيما يلي:

انتخاب الآباء في برامج التربية:

يحكم انتخاب الآباء المستخدمة في عمليات التهجين العديد من الاعتبارات والتي يمكن تلخيصها فيما يلي:

1. الأصناف التي يشيع فيها تواجد الأجنة الجنسية (الزيجوتية) إلى درجة كبيرة مثل الشادوك تكون مفضلة كأمهات، وهناك بعض الأصناف الزيجوتية الأخرى مثل اليوسفي الكلمنتين وKishiu ويوسفي Wilkin و Temple orange، كما استخدم العديد من الأصناف التي يمكن أن تعطي أجنة هجين كأمهات مثل اليوسفي King والبرتقال Ruby والليمون الأضاليا صنفي يوريكا ولزبون.

2. بالنسبة للتربية للأصول يجب أن يكون أحد الآباء منتجا للأجنة النيوسيلية ليكون الأصل به هذه الصفة عند الانتخاب، ويمكن التغاضي عن ذلك إذا كانت مزارع الأجنة (الإكثار المعملي) رخيصة.

3. تنتج الأجنة الجنسية عندما تكون الآباء وحيدة الجنين وإذا كانت الأصناف وحيدة الأجنة غير مناسبة فإنه يمكن أن تستخدم بعض الآباء التي تنتج بعض الأجنة النيوسيلية، وفي بعض الأصناف يكون إنتاج الأجنة الجنسية قليل بدرجة كبيرة (نادر) ولذا لا يمكن استخدامها كآباء في عمليات التهجين.

4. عندما تحتوي بذور أحد الآباء على أجنة نيوسيلية، فإن استخدام الأب المذكر المحتوي على صفة مميزة في الأوراق يكون مهم في التهجين لأنها تسمح بالتعرف على الهجن الناتجة (كما هو الحال في استخدام البرتقال الثلاثي الأوراق في التهجينات).

5. معظم الأصناف في الموالح غير متجانسة وراثيا ولذا فإن التلقيح الذاتي أو التهجين بين الآباء المتقاربة وراثيا لدرجة كبيرة قد يكون مفيدا ولكن غالبا ما يكون هذا النسل أضعف وأقل نوعية من الآباء، كما أن التلقيح الذاتي يقف في طريقه عقبة تواجد عدد كبير من الأجنة النيوسيلية وعدم التوافق الذاتي، إلا أن التلقيح الذاتي لأفراد الجيل الأول (الغير متجانس وراثيا) يمكن أن يكون مفيدا، وعموما فالتهجينات البعيدة أو البعيدة نسبيا والتلقيح بين أفراد الجيل الثاني هي أكثر التهجينات فائدة.

6. تختار الأصناف التي تحمل الصفات المرغوبة لاستخدامها كآباء وأمكن توريث بعض الصفات ووجد أن معظمها تورث بطريقة كمية، ولكن ليس هناك ضمان أن تنتقل هذه الصفات من الآباء إلى الأبناء بصفة منتظمة، ويوجد تدرج في الصفات في الجيل الأول وكذا في الأجيال التالية، إلا أنه يوجد العديد من المواصفات والتي يكون توارثها سائدا وغير مرغوبة مثل الطعم المر في الثمار، واللون الغير مرغوب في القشرة أو العصير، والغشاء الصلب للفصوص وصغر حجم الثمار، وكثرة عدد البذور بها، مما يجعل التكهن بمواصفات الهجن الناتجة صعبا.

7. هناك بعض المعلومات الخاصة بانتخاب الآباء بهدف التربية لبعض الصفات الخاصة مثل مقاومة النيماتودا.

8. يساعد استخدام مزارع الأنسجة في إجراء التهجينات على تخطي الحواجز للتهجينات المتباعدة وإنتاج هجن ذات صفات وراثية من مصادر متباعدة لا يمكن إنتاجها بالطرق التقليدية.

9. لا يوجد إلى الآن إلا معلومات قليلة عن درجات التالف العام والخاص بين مختلف الأصناف لذلك فمن الصعب الحكم على ذلك لانتخاب الآباء.

طرق إجراء التهجين في أشجار الموالح:

تختلف نسبة اللقاح الجيد في الأنواع والأصناف فمثلا البرتقال أبو سره لا ينتج حبوب لقاح بالمرة، بينما ينتج يوسفي الساتزوما كمية قليلة جدا من اللقاح وينتج الجريب فروت Marsh (عديم البذور) حبوب لقاح جيدة بنسبة 5-15% بينما تحتوي معظم أصناف الليمون والبرتقال التجارية على مستويات وسطية من حبوب اللقاح الحية وتكون النسبة منخفضة في بعضها (25%)، وتحتوي معظم أصناف اليوسفي والشادوك على حبوب لقاح حية بنسبة مرتفعة، وفي البرتقال أبوسره (واشنطن) والأصناف المشابهة وبعض الهجن يحدث تحلل للنسيج المكون لحبوب اللقاح قبل حدوث الانقسام الميوزي، وفي اليوسفي الساتزوما يكون عدد الخلايا الحية لحبوب اللقاح قليل وتتحلل معظم حبوب اللقاح المتكونة، وفي الليمون المالح limes وأصناف البرتقال قليلة البذور يحدث العديد من الأوضاع الشاذة في الانقسام الميوزي مما ينتج عنه العقم المشاهد في هذه الحالات (1958 ,Naithani & Raghavanshi و ,Iwamaso 1966) وقد يؤدي تعرض الأشجار لحرارة تحت 19 م إلى زيادة الأوضاع الغير طبيعية في الانقسام الميوزي في أصناف الليمون، كما ظهرت درجات عقم أكبر في أشجار الساتزوما.

وقد وجد عامل وراثي مسئول عن عدم تزاوج الكروموزومات في صنف اليوسفي Vardi and Spiegel - Roy, 1982) Wilking). وقد لوحظ أن الأصناف ذات حبوب اللقاح الغير فعاله يظهر فيها بصفة عامة حالات مشابهة من ضمور المبيض ولكن البرتقال أبو سره تتواجد به بعض البويضات الجيدة.

التلقيح الذاتي والخلطي وعلاقته بالتحسين الوراثي للموالح بالتهجين:

التلقيح الذاتي يتم بتلقيح الميسم من متك نفس الزهرة أو من نفس النبات كما أن إخصاب البويضة بجرثومة من نفس النبات هو إخصابا ذاتيا، وعندما يتم إكثار النبات خضريا فإن جميع النباتات تكون ذات تركيب وراثي واحد (إلا إذا حدثت بعض الطفرات) والتلقيح أو الإخصاب بين تلك الأشجار المتطابقة يعتبر تلقيحه ذاتيا أو إخصابا ذاتيا ويوازي التلقيح الذاتي لنفس النبات.

التلقيح الخلطي والإخصاب الخلطي يشمل انتقال حبة اللقاح من نبات من صنف إلى صنف آخر، ومن الواضح أن هناك اختلافا وراثية بين التلقيح الخلطي والتلقيح الذاتي فقط عندما يكون النباتين مختلفين وراثية لدرجة ما.

ويتم التلقيح الذاتي في الموالح عن طريق احتكاك الميسم مع المنتك أو باللقاح المنتثر والذي يهب على الميسم أو انتقالها عن طريق الحشرات، وحبوب اللقاح في الموالح من النوع اللاصق أو اللزج المميز للنباتات التي تلقح بالحشرات توصف بأنها نباتات Entomophilous. وعليه فالرياح ذات أهمية قليلة في حالة الأزهار التي يتم التلقيح فيها بالحشرات، وتوجد في الأزهار تلقح بواسطة الحشرات أربعة عوامل تجعل الأزهار جذابة للحشرات وهي الكورولا الواضحة – الرائحة - اللقاح - النكتار. ومن الواضح أن التلقيح الخلطي يحدث أساسا عن طريق النحل وبعض الحشرات الأخرى والتي تجذبها الأزهار لجمع الرحيق وحبوب اللقاح، بالإضافة لذلك قد يقوم بهذا العمل كل من التربس والحلم والذي يتواجد في الأزهار ليتغذى على حبوب اللقاح.

وفي العديد من أصناف الموالح التي يوجد بها حبوب لقاح جيدة يتم فيها التلقيح الذاتي والعقد بدون الحاجة للحشرات حتى في حالة منع وصول الحشرات لها، كما يجب أن يؤخذ في الاعتبار في حالة الرغبة في إجراء التهجينات تفادي التلقيح الذاتي ويساعد ذلك وجود بعض الأنواع والأصناف التي بها مسببات العقم الذاتي مثل حالة نضج المتوك قبل المياسم (Proterandous) مما يسبب العقم الذاتي، بينما في البعض الأخر يتم النضج في نفس الوقت والذي يساعد على إتمام التلقيح الذاتي.

 خطوات إجراء التهجين:

تجمع حبوب اللقاح من أفرع منتخبة وتفضل الأزهار المبكرة الكبيرة الحجم من النورة عن الأزهار الصغيرة، وفي حالة تكييس النورات فإنه يمكن جمع الأزهار المتفتحة من الأكياس مباشرة واستخدام اللقاح في تلقيح الأزهار التي تم خصيها، وفي حالة عدم تكيس الأزهار فإنه يتم جمعها قبل أن تتفتح ويتم إزالة التويج والمتاع وتترك المتوك لكي تنضج وتنتثر حبوب اللقاح ويحدث ذلك بعد 12-24 ساعة بعد جمع الأزهار على درجة حرارة الغرفة، ثم يتم جمع حبوب اللقاح وتوضع في أنابيب أو زجاجات صغيرة وتغلق فوهاتها بقطعة من القطن وتخزن تخزينا جافا إلى أن يتم استخدامها، وبوجه عام فإن تخزين حبوب اللقاح لجنس الموالح غير ضروري إلا في حالة نقل حبوب اللقاح لمسافات بعيدة أو عندما تتباعد مواعيد أزهار الآباء المستخدمة في التهجين، ويتم تخزين حبوب اللقاح في مكان جاف في عبوات خاصة على درجة حرارة 4 م أو أقل، ويمكن حفظ حبوب اللقاح على جيل السيليكا على درجة حرارة (- 20 م) لمدة ثلاثة سنوات بدون فقد في

حيويتها (Kobayashi et al 1978) كما وجدوا أن حبوب اللقاح المخزنة على النيتروجين السائل تكون نسبة إنباتها %90 بعد سنتين.

وبالنسبة للأزهار التي سيتم تلقيحها فإنه يتم خصيها قبل إجراء التلقيح، لذا فإنه يجب عدم تلقيح الأزهار التي أنتثر المتوك فيها ويحدث ذلك بعد انفصال التويج، ولكن في الشادوك فإنه يتم حدوث انتثار حبوب اللقاح من المتوك في الأزهار التي لازالت مغلقة، ويمكن خصي عدة أزهار على نفس الفرع المنتخب، ويتم الخصي باستخدام ملقط يتم تعقيمه دوريا خاصة عند الانتقال من شجرة إلى أخرى, وتكيس الأزهار المخصبة بعد ذلك، وقد وجد أن نسبة العقد تتحسن بإزالة الأزهار والثمار الأخرى الموجودة على نفس الفرع، ويمكن إجراء التلقيح (التهجين) مباشرة بعد الخصي أو بعد ذلك بعدة أيام معتمدا على حالة الأزهار والتي يمكن تحديدها عن طريق ظهورا لمادة اللزجة على الميسم والذي يبقى مستقبلا لحبوب اللقاح لعدة أيام، أما بالنسبة للأصناف الغير متوافقة ذاتيا فمن الممكن أن ينجح فيها التلقيح الذاتي إذا

أجرى قبل تفتح الأزهار بثلاث إلى أربعة أيام. وتكييس الأزهار بعد التلقيح ثانية، وتزال الأكياس بعد أسبوعين لتفادي تراكم الآفات والأمراض. ويتم استخدام علامة مميزة لكل هجين على أن تكون مقاومة للظروف البيئية المختلفة، وبعد عدة أسابيع يمكن تغطية الثمار التي عقدت بأكياس بها ثقوب لكي تمنع تساقط ما قبل الجمع. ويقوم بعض العاملين في هذا المجال بإزالة البتلات (والتي تكون كعامل جذب للحشرات) عند الخصى ثم يجري التلقيح مباشرة ولا تكيس الأزهار في هذه الحالة. ولكن هذه الطريقة لا يمكن استخدامها عندما يكون من المطلوب إجراء دراسات وراثية لعدم ضمان حدوث التلوث.

ومن المهم التأكد من حيوية حبوب اللقاح إما باستخدام صبغة الاسيتوكارمن أو اليود أو الفلورسین ثنائي الخلات Fluorescein diacetate، ولكن يفضل إجراء اختبار إنبات لحبوب اللقاح باستخدام محلول 20% سكروز على درجة حرارة 20-25 م مع الأخذ في الاعتبار أنه توجد اختلافات بين الأصناف في التركيز الأمثل للسكروز في المحلول (1978 ,Kobayashi) حيث وجد أن بعض الأصناف تنبت حبوب لقاحها عند تركيز 15% من السكروز والبعض الأخر عند تركيز 50%. ويمكن استخدام النقطة المعلقة لهذا الاختبار أو الأجار بنسبة 1% في أطباق بتري مغطاة ثم الفحص الميكروسكوبي.

يعمل السائل اللزج الذي يفرزه الميسم على التصاق حبة اللقاح على الميسم وتوفير البيئة المناسبة لإنباتها وقد وجد كل من (1960 , Singh & Dharia و 1961 Randhawa .et al) أن الميسم يكون مستعد لاستقبال حبوب اللقاح لفترة من 1 إلى 3 أيام قبل تفتح الأزهار ويحتفظ بحالته المستقبلية لمدة 6-8 أيام بعد التفتح، وقد أثبت التلقيح البرعمي انه ناجح وتنمو الأنبوبة اللقاحية حتى أربعة أيام قبل التفتح (1957 ,Fujita). وتمتص حبة اللقاح الرطوبة من الميسم وتنمو الأنبوبة اللقاحية خلال أنسجة القلم وإلى فصوص المبيض ثم الميكروبيل لكل بويضة وتؤدي إلى إزاحة واحدة أو كلا الخليتين المساعدتين مع دخولها إلى الكيس الجنيني (1943 Banerji, 1954 & Bacchi) ثم تخرج أحد النواتين الجرثوميتين وتلتحم مع نواة البويضة وتلتحم النواة الجرثومية الأخرى مع النواتين القطبيتين لتكوين الأندوسبرم ( 1954,Banerji)، وتتراوح الفترة من التلقيح إلى الإخصاب من يوم إلى أربعة أسابيع (1912 Osawa و 1930 ,Toxopeus) وفي الجريب فروت (صنف فوستر) وجد (1943,Bacchi) أن الإخصاب قد حدث بعد أربعة أيام، كما وجد (1953 ,Furusato) أن الإخصاب قد حدث في يوسفي الساتزوما بعد فترة من 2-8 أيام.

وقد وجد أن إزالة الميسم بعد 2-3 أيام بعد التلقيح لم يمنع تكوين البذور. وتكون الفترة القصيرة لحدوث الإخصاب هي الممثلة للواقع في الموالح النامية تحت الظروف المناسبة، ويمكن أن يتأثر نمو الأنبوبة اللقاحية بدرجة كبيرة بالظروف المناخية أو بعدم التوافق، وقد ذكر (1960 , Gerasimiova & Navashina) أن الاتحاد بين الجاميطات (الاندماج يعتمد على درجة الحرارة السائدة وحالة الجاميطات نفسها. وقد وجد (1912 ,(Osawa أن أول انقسام في بويضة البرتقال الثلاثي الأوراق المخصبة قد حدث بعد الإخصاب بفترة 2-4 أسابيع، وقد ذكر (1943 ,Bacchi) أن أول انقسام قد حدث بعد 50 يوم من الإخصاب، وقد وجد (1952 , Furasato) أن مدتها حوالي شهر، وأن أول انقسام في البويضة المخصبة عرضية والخلايا القريبة من طرف الميكروبيل من الكيس الجنيني يتكون منها المعلق Suspensor وتنقسم الخلية القمية لتكون كتلة مستديرة من الخلايا. وبعد ذلك تؤدي النموات الخارجية Outgrowths كبدايات للأجزاء المختلفة من الجنين الكامل (السويقة السفلى – الجذير – الفلقات - السويقة العليا والريشة).

وفي العديد من الأصناف في أنواع Citrus, Fortunella, Poncirus تتكون أجنة إضافية مشتقة من الخلايا الخضرية للنيوسيلية وتنمو هذه الأجنة في الكيس الجنيني وتستقر بجانب الجنين الجنسي ويحدث ذلك بعد الإخصاب وقبل أو مع بداية الانقسام الأول في البويضة (1912 , Bacchi, 1943 ، Toxopeus, 1930 ، Osawa و ,Furasato 1953) وتوضح القطاعات المصبوغة للمبيض وجود عدد من الخلايا الكبيرة وبها نواه كبيرة الحجم وسيتوبلازم كثيف في النيوسيلة، وتتواجد هذه الخلايا أساسا بالقرب من الطرف الميكروبيلي للكيس الجنينی وفي حدود 1-2 طبقة من طبقات الخلايا فيه وتبدأ بعض هذه الخلايا في الانقسام وتكون كتل صغيرة من الخلايا والتي تمتد في داخل الكيس الجنين بجانب الجنين الجنسي، وفي المراحل الأولى من تكون هذه الأجنة فإنه يمكن تميزها عن طريق شكلها غير المنتظم وعدم تواجد الحامل الجيني Suspensor ولكن (1958 ,Mahshwari & Rang Swamy) وجدا أن هذه الأجنة يكون بها حوامل أيضا وأن هذه الأجنة التي سبق شرحها هي الأجنة النيوسيلية ,Toxopeus) (1930، والعلاقة في توقيت بداية تكوين الجنين الجرثومي والأجنة الخضرية قد تكون متباينة إلى درجة كبيرة. ففي المراحل المبكرة تكون الأجنة الخضرية أقل تطورا من الجنين الجرثومي، ولكن (1951 ,Vasilicovaو 1930 ,Toxopeus) وجدا أن معظم الأجنة النيوسيلية كانت متعددة الخلايا في نفس الوقت الذي بدأت فيه البويضة المخصبة في الانقسام.

وقد لوحظ أنه قبل بداية البويضة في الانقسام يبدأ الكيس الجنيني في الكبر بسرعة مما ينتج عنه تهشم العديد من الخلايا النيوسيلية وتنقسم نواة الأندوسيرم (3ن) انقسامات حرة (بدون تكوين جدر) وتصبح الأنوية مبعثرة في طبقة رقيقة من السيتوبلازم الذي يحيط بالكيس الجنيني من الداخل. وقد وجد (1943 ,Bacchi) أن مرحلة الأنوية الحرة في الأندوسبرم كانت متواجدة بعد 67 يوم من التلقيح ويتكون بعد ذلك جدر خلايا الأندوسبرم وتستمر هذه الخلايا في الانقسام لتكون نسيج الأندوسبرم والذي ينقل المواد الغذائية إلى الأجنة النامية.

نمو الأجنة في الموالح

كما ذكر من قبل فإنه قد يحدث الإخصاب ويتكون الجنين الجنسي ولكن قد لا يمكنه الاستمرار في النمو وتكوين جنين قادر على الإنبات، وإذا لم يتكون الجنين الجنسي فيدل ذلك على عقم زيجوتی كامل، وهذا النوع من العقم إما أن يكون لأسباب وراثية أو غير وراثية ويكون تواجد بذور فارغة (القصرة فارغة تقريبا) دليلا على إجهاض الجنين، والبذور التي تنتج أجنة نيوسيلية فقط تدل على فشل أو احتمال غياب الجنين الجنسي. وكما ذكر من قبل فإن غياب عملية التلقيح تمنع تكوين الأجنة النيوسيلية، وعلى ذلك فالعقم الذكرى الكامل (وبدون تواجد التلقيح الخلطي) ينتج ثمارا بدون بذور، ونظرا لأن الأجنة النيوسيلية تنمو في الكيس الجنيني فأن هذه الأجنة قد لا تتكون إلا إذا كان الكيس الجنيني جيد التكوين. ونظرا لأن بعض الأصناف تنتج بادرات نیوسيلية أساسا أو غالبا، وفي أصناف الأخرى فإن العديد من البذور تنتج بادرات نیوسيلية فقط، لذلك فأن إجهاض الجنين الجنسي قد لا يمنع بالتبعية وبالضرورة تكوين ونمو الأجنة النيوسيلية. وعليه فيمكن القول بصفة عامة أنه عادة ما يؤدي العقم الذكرى إلى العقم النيوسيلي ولكن إجهاض الجنين الجنسي لا يؤدي بالضرورة للعقم النيوسيلي.

وقد تسبب تواجد الأجنة النيوسيلية وشيوع العقم في الأصناف المختلفة من الموالح في صعوبة الحصول على أدلة مناسبة عن العلاقة بين التهجينات المعروفة والعقم، وفي أي محاولة مناسبة لتقييم الخصوبة أو العقم لبعض الأشجار المنتخبة فإنه من الضروري أن يؤخذ في الاعتبار ما يلي:

• المقدرة على الإثمار الجيد.

• عدد البذور/ الثمرة.

• عدد الأجنة/ البذرة.

• نسبة الأجنة الخضرية الجنين الجنسي.

• احتمال تكون الأجنة النيوسيلية رغم تواجد عقم جاميطي أنثوي في الاعتبار.

ومن المؤكد في الموالح أنه يوجد العديد من الهجن النوعية الحقيقية التي يمكن إنتاجها كما يلي:

• وجد العديد من الهجن النوعية بين الأجناس، ففي تجربة تلقيح مفتوح لعدد 56 هجين من الجيل الأول لأربعة أصناف من جنس الموالح Citrus مع P. trifoliate وجود أجنة جنسية في 43 منها وأجنة نيوسيلية في ال13 الأخرى، ويدل ذلك على أن هناك درجة عالية من الخصوبة الأنثوية في هذه الهجن بين الأجناس.

• وجد أن العديد من الهجن النوعية بين الأنواع المختلفة لجنس الموالح Citrus كانت خصبة ومما يؤكد ذلك نسبة عقد الثمار، وعدد البذور، وحيوية حبوب اللقاح، وكانت نسبة الأجنة النيوسيلية غالبا مرتفعة مما جعل من المستحيل تحديد درجة الخصوبة الجنسية للأمهات، ولكن كان واضحا أن درجة الخصوبة كانت متباينة وراثيا بين هجن الجيل الأول من نفس الهجين، فبعض الهجن الناتجة من آباء بها عقم شديد تكون أيضا عقيمة ويحدث فيها تحلل لحبوب اللقاح وتتكون البذور بكمية قليلة وتكون نسبة العقد بها منخفضة، بينما تكون الهجن الأخرى بذرية بدرجة واضحة مع أن معظم البادرات الناتجة تكون من أجنة نيوسيلية.

وأخيرا فإنه من الواضح أن تواجد الأجنة النيوسيلية يساهم في التعبير عن مظهر العقم الأنثوي. وفي المجتمع الانعزالي لتعدد الأجنة فإن الأفراد وحيدة الجنين تظهر درجة كبيرة من العقم الجنسي. ولكن البادرات الجنسية تكون قليلة العدد أو غائبة في النسل من الأفراد متعددة الأجنة. وهذا الارتباط الكبير بين العقم الجنسي وتعدد الأجنة لا يكون محتملا فالعديد من الأفراد التي تنتج بادرات نیوسيلية تكون جميعها تقريبا خصبة ذكريا (لقاح جيد).

تعدد الأجنة في البذور وتأثيرها علي نجاح التهجين في الموالح

تشيع صفة تعدد الأجنة في الموالح مما يؤثر على الطرق المستخدمة في برامج التربية وعلى النتائج المتحصل عليها، ويتواجد في العديد من الأصناف عدد قليل جدا من البادرات التي يمكن استرجاعها من الأجنة الجنسية. وتبدأ الأجنة النيوسيلية في النمو بدون تلقيح ولكنها تفشل في الاستمرار في النمو إذا لم يتواجد نسج أندوسبرم نامي وكافي 1987 , Wakana & Uemoto ويتم تلقيح خلية البويضة في الموالح بعد 2-3 أيام أو عدة أسابيع بعد التلقيح ويبدأ انقسام الخلايا بعد ذلك وفي خلال هذا الوقت يتكون الأندوسبرم عديد الأنويه ويملا الكيس الجنيني، والأندوسبرم نسيج مرحلي يختفي فيما بعد تماما. وفيما عدا الأصناف التي تكون بذورها جنسية بدرجة كبيرة فإن الجنين الجنسي يتنافس في المكان والغذاء مع واحد أو أكثر من الأجنة النيوسيلية، ويحتوي الكيس الجنيني على عدد قليل من الأجنة التي تنمو طبيعية مع البعض الآخر الذي لا ينمو كلية، وتعتمد النتائج فيما يخص عدد الأجنة في الكيس الجنيني على العدد والموقع ومعدل التطور للأجنة النيوسيلية وكذلك على قوة النمو الموروثة مقارنة بالجنين الجنسي وتدل النتائج على أن العديد من الأجنة تفشل في الإنبات والوصول إلى مرحلة البادرة. وبعض الأصناف تحتوي على العديد من الأجنة في معظم بذورها ولكن القليل منها تنتج 2-3 بادرات. والعدد القليل من الأجنة لكل بذرة تنتج فيها جنين كبير الحجم وهناك احتمال أكبر لبقاء الجنين الجنسي حيا. وتختلف أنواع وأصناف الموالح في احتواء بذورها على أجنة نيوسيلية، ويمكن توضيح بعض هذه الاختلافات فيما يلي:

• وتنتج بعض أصناف اليوسفي بادرات جنسية بينما ينتج البعض الآخر أجنة خضرية، وتنتج معظم أصناف Lemon, Lime عدد كبير من الأجنة الجنسية.

• تنتج بذور الجريب فروت عددا قليلا من الأجنة الجنسية.

• تنتج أصناف البرتقال عددا كبيرا من الأجنة الجنسية ولكن استرجاع هذه البادرات يكون متفاوتا ولا يمكن التكهن به (1977,Hearn).

ولم تكن المعاملات المختلفة التي تجري لزيادة كفاءة استرجاع البادرات الجنسية فعاله لدرجة كبيرة. ولو أن بعض النجاح في هذا الخصوص قد تحقق بواسطة Soost 1987 حيث ذكر زيادة كبيرة في الأجنة الجنسية بعد تشعيع الثمار لمدة 32 يوم بمعدل 300-200 راد من أشعة جاما/ اليوم، ولكن وجد أيضا أن الأب يمكن أن يؤثر أحيانا على مواصفات البادرات الجنسية حيث وجد أن الليمون المخرفش مع التلقيح الذاتي أنتجت بذوره بادرات نیوسيلية فقط، بينما عند استخدم لقاح من البرتقال الثلاثي الأوراق كان 46% من البادرات جنسية، وبوجه عام فقد ازداد العدد المتوفر من الأصناف وحيدة الجنين من خلال الانتخاب في الهجن المختلفة.

ويختلف العدد الكلي للأجنة الموجودة في البذرة بدرجة كبيرة في الثمار على نفس الشجرة، وكذا في داخل نفس الصنف (1988 , Khan & Roose و ,Anderson et al 1991 حيث لوحظت اختلافات كثيرة وكبيرة في نفس الصنف بين المواقع والسنوات وكذا بالنسبة للأصل المستخدم لتطعيم نفس الصنف، وبدون شك فهناك عوامل داخلية وخارجية تؤثر على تلك الصفات، وتوجد درجة ثبات قليلة جدا في داخل النوع الذي يتواجد به أجنة نيوسيلية. ولكن هناك أساسا العوامل الوراثية العديدة التي تتحكم في ذلك وأن تعدد الأجنة يحكمها صفات وراثية محددة ولكن مقدار تأثير العوامل البيئية على التعبير عن هذه الظاهرة لا يمكن تجاهله.

وليس من الضروري أن تكون الأجنة المتعددة بالبذرة نيوسيلية فبعض الأصناف التي تكون عادة وحيدة الجنين ولكنها تعطي 2 أو أكثر من الأجنة وجميعها جنسية واتضح أنها تكون عبارة عن توائم، ويمكن التعرف على ذلك بسهولة باستخدام البرتقال الثلاثي الأوراق حيث أن صفة ثلاثية الأوراق صفة سائدة عند استخدامه كملقح. وفي دراسة حقلية للعديد من هذه الأفراد أتضح أن هناك أفراد متماثلة وراثيا وقد تكون توائم ثنائية أو ثلاثية وأنها نشأت في الأصل عن طريق الانقسام من الجنين الجنسي. والأصناف التي تنتج بادرات نيوسيلية أيضا يمكن أن تنتج أكثر من جنين جنسي وتكون هذه عبارة عن توأم، ولكن لم يثبت أن الأصناف وحيدة الجنين يمكن أن تنتج أجنة نيوسيلية تحت الظروف العادية.

استخلاص البذور الناتجة عن التهجين وحفظها وتخزينها:

يمكن حفظ الثمار في المعمل لمدة عدة أيام بدون استخلاص البذور وتمتد هذه الفترة كثيرا في الثلاجة لتصل إلى عدة أسابيع ولكن يمكن أن تحدث الإصابة بالفطريات حتى مع تواجد الثمار في الثلاجة، ويتم استخلاص البذور وغسلها. وللتخلص من الفطر البني (P. parasatica Dastur & Phytophthora citrophthora SM &SM.)Leoniar) يجب معاملة البذور بالماء الساخن بوضع كل 2-3 كجم بذرة في قطعة من الشاش في حمام مائي على درجة حرارة 51-52 م لمدة 10 دقائق وذلك للتخلص من الفطريات التي قد تكون داخل البذرة، ثم تغمر البذور بعد ذلك مباشرة في محلول المبيد الفطري 8- هیدروکس سلفات الكوينولين 8-Hydroxy Quinoline Sulphate بتركيز 1% لمدة 3 دقائق وذلك للتخلص من الفطريات التي تسبب مرض الذبول كما تؤدي إلى القضاء على فطر Aspergillus flavus الذي يعتبر احد أسباب التي تؤدي إلى ظاهرة الشتلات الالبينو، وبعد المعاملة تجفف البذور في مكان مظلل جيد التهوية ثم تعبأ بعد ذلك في أكياس بلاستيكية ويتراوح وزن البذرة بالكيس من 2-3 كجم، مع وضع بطاقة مع كل كيس يكتب عليها أسم الأصل وتاريخ استخراج البذرة، ويمكن حفظ البذور على درجة حرارة 1.5 - 7.5م لمدة تصل إلى ثمانية شهور (ويختلف هذا باختلاف الأصناف)، وقد حفظت بذور البرتقال الثلاثي الأوراق لمدة سنتين بدون فقد في المقدرة على الإنبات أو في نسبة الإنبات، ولكن من الملاحظ أنه يمكن الحصول على أفضل نسبة لإنبات معظم أصول الموالح عند زراعة البذور بعد الاستخلاص مباشرة وتنخفض نسبة الإنبات بزيادة فترة التخزين.

وتحت الظروف العادية فإن بذور الموالح تكون حساسة جدا للجفاف ولذا فيجب أن يتم التجفيف في مكان مظلل جيد التهوية وليس تحت أشعة الشمس المباشرة حتى يتم إزالة الرطوبة الموجودة على سطح البذور فقط مع ملاحظ أن نسبة إنبات بعض الأصناف تقل عندما يتم التجفيف حتى لمدة عدة ساعات. ونظرا لأن البذور هي ناتج عملية التهجين والتي عن طريقها سوف يتم الحصول على النباتات أو الهجن، لذلك من المفيد الإلمام ببعض المعلومات عن البذور كما يلي:

1. مورفولوجي البذور:

تتكون البذرة الناضجة من واحد أو أكثر من الأجنة محاطة بعدد بغطائين للبذرة ولا يتواجد الأندروسبرم أو النيوسيلة في هذا الوقت إلا إذا كانت قد ساهمت في تركيب الجدار الداخلي (Tagmen)، وهذا الجدار الرقيق يحيط بالجنين أو الأجنة، ويتكون إلى حد بعيد من جدر المبيض Integuments. وتكون نهاية الكلازا من الجدار الرقيق Tagmen ملونة بلون خاص، ويساعد ذلك في التعرف على الصنف أو المجاميع. ويطلق على غطاء البذرة الخارجي القصرة Testa والذي يكون لونه أبيض رمادي أو كريمي وصلب ومتخشب ويكون عادة متصلب rigid أو مجعد وعادة يمتد فيما بعد الجنين عند طرف أو طرفي البذرة لتكوين منقار أو تركيب مسطح، وفي بعض البذور عديدة الأجنة فإن السطح يصبح متموجا نظرا لعدم النمو المنتظم للأجنة. وكل جنين يتكون من فلقات لحمية تكون متصلة بسويقه سفلى قصيرة بدرجة كبيرة وعند أحد أطراف السويقة السفلى، وتتواجد بين الفلقات ريشة Plumule صغيرة جدا وعلى الطرف الآخر يتواجد الجذير (مبادئ الجذر). وتكون الأجنة كتلة صلبة تتجه الجذور فيها إلى الميكروبيل من البذرة. وفي العديد من الأصناف قد يتواجد جنين جنسي أولا يتواجد ويوجد فقط أجنة لا جنسية (نيوسلية)، وتتساوي الفلقتان تقريبا في الحجم والشكل في البذور وحيدة الجنين ولكن تختلف الفلقتان كثيرا في حالة تواجد الأجنة الخضرية. والأجنة العديدة تكون عادة مزدحمة مثلا عند الطرف الذي يوجد به الميكروبيل ويكون بعضها صغير وغير جيد التكوين في الفلقات وقد تتواجد أجنة صغيرة على الجانب الخارجي للفلقات الكبيرة أو فيما بعد بين فلقتان كبيرتان. ويعتبر شكل البذور مميزا لبعض الأصناف والأنواع، إلا أن بذور الصنف الواحد قد تتباين كثيرا في الحجم حيث يتأثر شكل البذور وحجمها بعدد البذور الثمرة وعدد الأجنة البذرة.

2. إنبات البذور:

يكون الإنبات في بذور تحت الجنس Eucitrus تحتي Hypogeous أو تبقى الفلقات تحت سطح التربة بينما يكون Epigeous في تحت الجنس Papeda وتخرج كلا من الريشة والجذير والسويقة العليا من النهاية الميكروبيلية للبذرة، ويخرج الجذير أولا وينمو بسرعة إلى أسفل وبدون تكوين جذور ثانوية مباشرة. وفي البذور عديدة الأجنة (خاصة) قد تعيق القصرة نمو الجذير مسببة له التقوس قبل خروجه وتكون السويقة العليا منحنية وهي تخرج من قصرة البذرة ولكنها تستقيم مع استمرار النمو وتتكون الورقتين الجنينيتين الأولى مقابلة لبعضهما على الساق ولا تتكون بنفس شكل الأوراق التي تتكون فيما بعد. ويعتقد في بعض الأحيان بأنهما الفلقات.

يتميز الإنبات في بذور الموالح بأنه يكون بطيئا ويستغرق من 2-4 أسابيع عند حرارة 20-25 م ويكون أبطأ وأكثر في عدم الانتظام عند درجات حرارة أقل من ذلك. بينما يكون الإنبات أسرع ما يمكن عند درجة حرارة 25م أو أكثر قليلا. ويمكن الإسراع من الإنبات عن طريق إزالة القصرة أو قطع نهاية الكلازا للغطاء الخارجي للبذرة. ويجب زراعة البذرة على عمق 1.5-2 سم من سطح التربة ويجب استخدام البيئات المناسبة التي توفر رطوبة وتهوية جيدة للإنبات ونمو البادرات. ويعتمد استمرار النمو على توفر العناصر الغذائية المعدنية.

وتشكل الإصابة بالفطريات بعد الإنبات مشكلة حادة وعلى ذلك يجب استخدام أواني زراعة وأوساط زراعة خالية من الفطريات، كما تتخذ الإجراءات اللازمة ضد أي إصابة بعد ذلك، وللمساعدة على منع الإصابة بمرض الذبول المتسبب لفطر Rhizoctonia يتم زيادة حموضة 3-5 سم من سطح التربة وذلك باستخدام سلفات أمونيوم بمعدل 35جم / 900 سم2 من سطح التربة، كما يستخدم مبيد فطري مناسب لرش البادرات بمجرد تكامل الإنبات، وإذا حدثت الإصابة فإنه لابد من استخدام مبيد فطري لكي يساعد في منع تطور المرض.

ويمكن استخدام الإكثار المعملي في بيئات معقمة لإنبات الأجنة الغير ناضجة أو الأجنة الصغيرة الحجم، ويجب تعقيم البذرة سطحيا ثم يتم إزالة الأجنة من قصرة البذور المعقمة ثم تنقل إلى بيئة الزراعة. وقد تم فصل الجنين الجنسي من بعض البذور متعدد الأجنة بعد 3-4 أشهر من التلقيح وتحتاج الأجنة الصغيرة لنموها إلى إضافة كازين مهدرج (Casein hydrolysate) في البيئة. (1969 ,Rangan et al). وعند النقل التالي إلى بيئة لا تحتوي على الكازين المهدرج يكون السكروز ضروريا لتكمله التطور.

تقييم البادرات (الهجن)

يعتبر التعرف على البادرات الجنسية في البذور التي تتواجد بها الأجنة النيوسيلية بمعدل مرتفع مشكلة للمربي إلا إذا كان الأب المستخدم في التهجين به بعض المواصفات الخاصة (مثلا ثلاثي الأوراق) والذي يساعد على التعرف على بادرات الهجين مباشرة بالطريقة المورفولوجية، أما في حالة عدم وجود مواصفات خاصة تميز أحد الآباء فإن تحليل الأيزوزومات أو استخدام RFLP في الورقة أو الفلقة يعتبر من أكثر الطرق فائدة لمعرفة السلوك الوراثي نظرا لما تتميز به العوامل الوراثية الأليلية ذات السيادة المرتبطة Roose, 1988) Codomunant alleles) ، ولا يوجد ارتباط بين خواص البذرة المورفولوجية وخواص الأشجار فيما بعد والتي تساعد في الانتخاب المبكر ولكن قد تعطي نتائج الأيزوزومات وال RFLP بعض الصفات المرتبطة لبعض المواصفات الهامة.

التهجين وقوة الهجين والتربية الذاتية:

يشيع عدم التجانس الوراثي في أشجار الفاكهة بصفة عامة، ومن المحتمل أن يكون ذلك هو الحال في جميع طرز الموالح، ويرجع ذلك إلى حدوث الطفرات عبر القرون وكذلك عن طريق التلقيح الخلطي، وفي العديد من النباتات نجد أن التلقيح بين الأنواع في داخل الجنس لا يحدث وإذا حدث تزاوج فإن النسل يكون عقيما نظرا للتباعد الوراثي ووجود حدود بين هذه الأنواع، أما في حالة الموالح فإننا نجد أن التهجين بين الأنواع ممكن حدوثه ويكون النسل خصبة في أفراد الجيل الأول.

وقد وجد أن التزاوج بين أجناس الموالح Citrus والكمكوات Fortunella والبرتقال ثلاثي الأوراق Pancirus ممكنا، ولكن التهجين بين الكمكوات والبرتقال الثلاثي الأوراق كان صعبا. (1923 ,Swingle and Robinson)، إلا أنه أمكن تهجين السترانج مع الكمكوات وأعطت قوة هجين نسبي، كما نجح التهجين بين Citrange و Erimocitrus، بينما حصل (1936 ,Toxopeus) على هجن ضعيفة من C.aurantifolia x Murraya paniculata، ولم ينجح التهجين بين الجنس Severinia X Citrus.

وتبدو الاختلافات الكبيرة في السلالات الجنسية متميزة على الأقل لجميع أنماط الموالح التي تنتج أجنة نيوسيلية، ويحدث التباين في جميع طرز الموالح بغض النظر إذا ما كانت الآباء تتبع نفس النوع أو أنواع أخرى أو إلى أجناس محددة. وقد لوحظ وجود اختلاف بين بعض هجن السترانج المنتجة مبكرا عن طريق التهجين الموجه بدرجة أكثر من الاختلافات الموجودة بين الآباء من أنواع مختلفة، وقد لاحظ مربوا الموالح وجود صور هذا التباين في تأثر معظم المواصفات بما فيها الحجم والشكل وقوة النمو والإصابة بالأمراض والعديد من موصفات الثمار، وبالرغم من أن الصفات الجديدة تكون في درجة وسط بين الآباء في معظم الحالات، إلا أنه توجد بعض الصفات التي قد تقارب أحد الآباء أو حتى تكون خارج حدود مواصفات الآباء.

وهناك أدلة على قوة الهجين في بعض الحالات وضعيفة في حالات أخري والناتج عن التزاوج الجنسي في الموالح ومن الأمثلة على كلا الحالتين ما يلي:

أ- وجد أن هجن السترانج كان أكثر قوة من الأجنة النيوسيلية للآباء لكلا النوعين من الآباء)، فقد وجد قوة هجين عند تهجين السترانج x الجريب فروت، وكذلك عند تهجين الكمكوات x الجريب فروت، وتهجين السترانج X الكمكوات، وكذلك عند تهجين الشادو (.x C.Grandis (L البرتقال الثلاثي الأوراق P.trifoliata ، الهجين الناتج عن تهجين كل من C.sinensis x C.paradisi x P.trifoliata، ويبدو أن التهجينات المتباعدة في الموالح هي الأكثر احتمالا لإنتاج أتسأل أكثر قوة في النمو.

ب- لوحظ ضعف نمو البادرات الناتجة من التلقيح الذاتي في الموالح إلا أن الحصول على نتائج محددة في هذا المجال تكون صعبة، والتلقيح الذاتي وخاصة في الحالات التي تم إكثارها لمدة طويلة بالأجنة النيوسيلية يكون ضار جدا وعادة تعطي معظم هذه الأصناف عدد قليل جدا من البادرات الجنسية، فقد لوحظ أن التلقيح الذاتي للصورة الخصبة ذاتية من الكليمانتين أعطت العديد من البادرات الضعيفة بينما أنتج التلقيح الذاتي في حالة Temple orange نباتات متوسطة في قوة نموها الخضري، كما لوحظ أن التهجتينات المتقاربة داخل جنس الموالح Citrus تكون غالبا أنسالها ذات نموا خضريا ضعيفا، فقد وجد (1943 ,Frost) في تجارب محدودة أنه حصل على هجن ضعيفة من التهجين ما بين صنفي البرتقال Valencia X Ruby، وما بين صنفي الليمون الأضاليا اليوريكا x لزبون، وفي هذا المجال فقد تم دراسة 100 هجين من أشجار اليوريكا x الزبون في ريفيرسايد بكاليفورنيا ولم يتحصل على أي شجرة من هذه الهجن على نفس قوة النمو الخضري للبادرات النيوسيلية الناتجة من الأمهات (لأي من الآباء) بالإضافة إلى ذلك فإن 47 شجرة (هجين) من ال100 شجرة (هجين) لم تنتج ثمار حتى عمر 11 سنة، بينما لوحظ أن التلقيحات المتبادلة من الجنس Citrus تنتج عادة هجن جيدة النمو الخضري للأنسال.

الطرق السيتولوجية في تقييم هجن الموالح

يعتبر فحص المجموعة الكروموزومبة للنبات سواء كان ذلك عن طريق فحص أعداد الكروموزومات أو أشكالها من الدراسات الأساسية في مجال التربية، إلا أنه نظرا لأن كروموزومات الموالح صغيرة الحجم (حواليum   2في الميتافيز للانقسام الميوزي). مما يجعل الدراسات المستفيضة غير مناسبة ولكن يمكن عمل تحضيرات للدراسات الروتينية وذلك بإجراء التالي:

• هرس الخلايا الأمية لحبوب اللقاح أو قمم الجذور أو القمم النامية أو الأجنة.

• معاملة هذه الأنسجة بال (O-isopropyl N-phenyl Carbomate (PC) (IPC بتركيز 25 جزء في المليون لمدة 2-3 ساعة، وقد تكون المعاملة باستخدام IPC غير ضرورية لجميع الأنسجة.

• تنبيت هذه الأنسجة بوضعها في خليط من الإيثانول وحمض البيوتريك بنسبة 2.5 مجم: 1 مجم لمدة 4- 24 ساعة. وإذا كانت المادة النباتية ستخزن فيجب نقلها بعد التثبيت باستخدام كحول أيثايل بتركيز 70%.

• تحلل الأنسجة مائيا Hydrolysis باستخدام حمض هيدروكلوريك بقوة واحد عياري (N1) على درجة حرارة 60 م (أنسب حرارة) وذلك لمدة تتراوح من 3-10 دقائق حسب نوعية النسيج يوضع النسيج في 1% -Acto propiomic – orcein وتهشم الأنسجة (تهرس).

• يمكن استخدام صبغة Glemsa من أجل دراسات أكثر تفصيلا (1988 ,Guolu).

• ويمكن تحفيز قمم الجذور والأنسجة الأخرى بالطريقة التقليدية (باستخدام البرافيين) ويكون Heidenhain's hematoxylin بتركيز 0.25% أنسب صبغة الشرائح الكروموزومات.